ตอบ:
Western blot (protein immunoblot) เป็นเทคนิคการวิเคราะห์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่ใช้ในการตรวจจับโปรตีนเฉพาะในตัวอย่างเนื้อเยื่อ homogenate หรือสารสกัด
คำอธิบาย:
องค์ประกอบหลักที่จำเป็นในการทำงานนี้ให้สำเร็จคือ:
- การแยกโปรตีนผสมตามขนาดโดยใช้เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส
- การถ่ายโอนโปรตีนที่แยกจากกันอย่างมีประสิทธิภาพไปสู่การสนับสนุนที่มั่นคง
- การตรวจจับเฉพาะโปรตีนเป้าหมายโดยแอนติบอดีที่จับคู่กันโดยประมาณ
ความสามารถของ Western blots ในการแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงการมีโปรตีนจำเพาะทั้งขนาดและการจับแอนติบอดีทำให้เหมาะสำหรับการประเมินระดับการแสดงออกของโปรตีนในเซลล์เพื่อตรวจสอบเศษส่วนในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์โปรตีน
ในหลายกรณีการใช้บลูสโคปแบบตะวันตกใช้ร่วมกับเทคนิคการตรวจจับแอนติบอดีที่สำคัญอื่น ๆ เช่น ELISA หรือเคมีอิมมูโนฮิสโต
จะเกิดปัญหาอะไรขึ้นหากแถบนั้นไม่ปรากฏใน Western Blot
หลายคน ... มีหลายสาเหตุที่ทำให้วงไม่ปรากฏบนดวงตะวัน ชุดตัวอย่างและแอนติบอดีทำงานในอดีตหรือไม่ ด้านล่างนี้เป็นเพียงบางส่วนที่ฉันสามารถคิดได้ในขณะนี้ที่อาจทำให้แถบไม่ปรากฏ: การถ่ายโอนโปรตีนจากเจลหรือไม่? ลองย้อมเมมเบรนด้วย ponceau S หรือ amido black เพื่อดูว่ามีวงอยู่หรือไม่ บางครั้งคุณสามารถเห็นแถบโปรตีนบนเมมเบรนโดยทำให้มันเปียกและถือมันเป็นมุมกับแสง แอนติบอดีปฐมภูมิทำงานหรือไม่ นี่คือการทดสอบที่ยากและวิธีเดียวที่คุณทำได้คือการรวมการควบคุมเชิงบวกที่คุณรู้ว่าคุณมีโปรตีนที่น่าสนใจ หากคุณมีโปรตีนที่น่าสนใจคุณสามารถลองตรวจดูที่เยื่อหุ้มเซลล์ blotting ตะวันตก (เช่นคุณไม่ได้ใช้เจล) และดูว่าคุณได้รับผลลัพธ์หรือไม่ถ้าคุณได้ผลลัพธ์จ
ทำไม GAPDH ถึงใช้ใน Western Blot + ตัวอย่าง
GAPDH มักใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด ในการซับแบบตะวันตกเรามักใช้ GAPDH เป็นตัวควบคุมการโหลด สิ่งนี้หมายความว่าโดยละเอียดสำหรับ GAPDH เราสามารถตรวจสอบว่าเรามีปริมาณโปรตีนที่เทียบเท่าในช่องทางต่าง ๆ ของ blot ตัวอย่างของการใช้งาน - บอกว่าเรามีโรคที่เราคิดว่าทำให้โปรตีนในเซลล์สูงขึ้น เราจะสร้างตัวอย่างจากเซลล์ "สุขภาพดี" และอีกตัวอย่างจากเซลล์ "โรค" จากนั้นเราจะโหลดปริมาณโปรตีนที่เท่ากันของตัวอย่างทั้งสองลงบนเจลสำหรับหยดดวงอาทิตย์ หลังจากการตรวจสอบปริมาณโปรตีนที่เราสนใจเราพบว่าในเซลล์ที่เป็นโรคนั้นระดับโปรตีนนั้นสูงขึ้นจริง ๆ (นั่นคือแถบสีเข้มจะถูกสร้างขึ้นบน blot) เพื่อพิสูจน์ว่าการเพิ่มขึ้นของโปรตีนนี้เกิดจาก
เหตุใดจึงต้องใช้ Western blot
Western blot เป็นการทดสอบที่ใช้เพื่อยืนยันการมีอยู่ของเอชไอวี / เอดส์ในร่างกาย