ตอบ:
หลายคน …
คำอธิบาย:
มีสาเหตุหลายประการที่ทำให้วงดนตรีไม่ปรากฎบนดวงตะวัน ชุดตัวอย่างและแอนติบอดีทำงานในอดีตหรือไม่
ด้านล่างเป็นเพียงบางส่วนที่ฉันสามารถคิดได้ในขณะนี้ที่อาจทำให้วงไม่ปรากฏ:
-
การถ่ายโอนโปรตีนจากเจลหรือไม่? ลองย้อมเมมเบรนด้วย ponceau S หรือ amido black เพื่อดูว่ามีวงอยู่หรือไม่ บางครั้งคุณสามารถเห็นแถบโปรตีนบนเมมเบรนโดยทำให้มันเปียกและถือมันเป็นมุมกับแสง
-
แอนติบอดีปฐมภูมิทำงานหรือไม่ นี่คือการทดสอบที่ยากและวิธีเดียวที่คุณทำได้คือการรวมการควบคุมเชิงบวกที่คุณรู้ว่าคุณมีโปรตีนที่น่าสนใจ หากคุณมีโปรตีนที่น่าสนใจคุณสามารถลองตรวจดูที่เยื่อหุ้มเซลล์ blotting ตะวันตก (เช่นคุณไม่ได้ใช้เจล) และดูว่าคุณได้รับผลลัพธ์หรือไม่ถ้าคุณได้ผลลัพธ์จากการประมวลผลของเยื่อหุ้มเซลล์ราวกับว่าเป็นรอยเปื้อนตะวันตก
-
แอนติบอดีรองรู้จักแอนติบอดีปฐมภูมิหรือไม่? อีกครั้งหนึ่งที่ยากลำบากในการทดสอบ เกี่ยวกับการทดสอบเพียงอย่างเดียวที่คุณทำได้คือการทดสอบเฉพาะจุดที่กล่าวถึงข้างต้นใน 2
-
"ระบบตรวจจับ" ทำงานหรือไม่ ขึ้นอยู่กับวิธีการตรวจจับที่คุณใช้คุณสามารถลอง spiking ในบางแอนติบอดีรองเพื่อดูว่าวิธีการตรวจสอบและยังเป็นตัวแทน / เอนไซม์ที่ทำงานบนแอนติบอดีรองทำงาน นั่นคือคุณสามารถกระตุ้นปฏิกิริยากับแอนติบอดีรองได้หรือไม่?
ในที่สุดมันอาจเป็นเรื่องง่ายเหมือนหนึ่งในวิธีการแก้ปัญหาที่ใช้ในระหว่างการตรวจสอบพล็อตที่ทำขึ้นอย่างไม่ถูกต้อง ตัวอย่างเช่นหากความเข้มข้นของเกลือผิดในบัฟเฟอร์สิ่งนี้อาจทำให้แอนติบอดีถูกปลดปล่อยออกจากส่วนที่เป็นหยด สิ่งเดียวกันก็จะเกิดขึ้นเช่นกันหากค่า pH ของบัฟเฟอร์ไม่ถูกต้อง
สาเหตุ "แปลกประหลาด" สำหรับ blot ตะวันตกที่ไม่ได้ทำงานที่ฉันมีประสบการณ์ส่วนตัวคือเมื่อเราเปลี่ยนซัพพลายเออร์ของนมผงที่เราใช้ในการปิดกั้นเมมเบรน ผงจากซัพพลายเออร์รายใหม่บรรจุ phosphotyrosine phosphatase ซึ่งลบกลุ่มฟอสเฟตทั้งหมดที่เราพยายามตรวจจับด้วยแอนติบอดีต่อต้าน phosphotyrosine ของเรา
ทำไม GAPDH ถึงใช้ใน Western Blot + ตัวอย่าง
GAPDH มักใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด ในการซับแบบตะวันตกเรามักใช้ GAPDH เป็นตัวควบคุมการโหลด สิ่งนี้หมายความว่าโดยละเอียดสำหรับ GAPDH เราสามารถตรวจสอบว่าเรามีปริมาณโปรตีนที่เทียบเท่าในช่องทางต่าง ๆ ของ blot ตัวอย่างของการใช้งาน - บอกว่าเรามีโรคที่เราคิดว่าทำให้โปรตีนในเซลล์สูงขึ้น เราจะสร้างตัวอย่างจากเซลล์ "สุขภาพดี" และอีกตัวอย่างจากเซลล์ "โรค" จากนั้นเราจะโหลดปริมาณโปรตีนที่เท่ากันของตัวอย่างทั้งสองลงบนเจลสำหรับหยดดวงอาทิตย์ หลังจากการตรวจสอบปริมาณโปรตีนที่เราสนใจเราพบว่าในเซลล์ที่เป็นโรคนั้นระดับโปรตีนนั้นสูงขึ้นจริง ๆ (นั่นคือแถบสีเข้มจะถูกสร้างขึ้นบน blot) เพื่อพิสูจน์ว่าการเพิ่มขึ้นของโปรตีนนี้เกิดจาก
เหตุใดจึงต้องใช้ Western blot
Western blot เป็นการทดสอบที่ใช้เพื่อยืนยันการมีอยู่ของเอชไอวี / เอดส์ในร่างกาย
เหตุใด Western blot จึงถูกใช้เพื่อยืนยัน Elisa + ตัวอย่าง
โดยทั่วไปแล้วนี่คือการทดสอบแอนติบอดีจำเพาะ ใน ELISA เป็นเรื่องยากมากที่จะบอกว่าแอนติบอดีของคุณจับกับโปรตีนที่คุณสนใจโปรตีนที่แตกต่างอย่างสิ้นเชิงหรือโปรตีนหลากหลายชนิด Western blot จะถูกใช้เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของแอนติบอดี (คุณควรทราบว่า Western blot อาจไม่ตรวจจับปฏิกิริยาข้ามทั้งหมดกับโปรตีนที่ไม่ถูกต้อง) ใน Western blot คุณสามารถดูขนาดของโปรตีนที่แอนติบอดีจับ (คุณไม่สามารถอยู่ใน ELISA) ตัวอย่างเช่นถ้าแอนติบอดีของคุณควรจับกับโปรตีน 56 kDa และคุณเห็นแถบที่ ~ 56 kDa บนจุดนั้นคุณจะมั่นใจได้อย่างสมเหตุสมผลว่าแอนติบอดีนั้นจะจับกับโปรตีนที่ถูกต้อง ในทางตรงกันข้ามถ้าคุณเห็นวงดนตรีที่ 32 kDa คุณสามารถสรุปได้ว่าแอนติบอดีนั้นจับกั